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细胞技术-细胞组分的分析方法
 

.基本原理

核酸分子杂交技术是目前分子生生物学、细胞生物学和生物化学研究中应用最广泛的技术之一,是定性、定量和定位检测两条来源不同的聚核苷酸链上碱基顺序同源性的一种手段。DNA分子是高度有序的双键分子。一条链的碱基与另一条链的碱基以氢键配对相连.形成腺嘌呤与胸腺嘧啶(AT),鸟嘌呤与胞嘧啶(GC)的特定碱基对;在RNA中则为AU(尿嘧啶)GC配对。

在碱性环境加热或加入变性剂的条件下,核酸分子双链之间的氢键被破坏,解链成两条单链(称为变性)。此时如果加入已知DNARNA片段(称为探针),在一定的离子强度和温度下,两条具有互补碱基顺序的DNA与相应的cDNARNARNA与相应的RNAcDNA均可形成双链分子结构(称为复性),这种由互补碱基顺序的任何单链核酸分子片段形成双链的过程称为分子杂交(Molecular hybridization)

核酸分子杂交可分为液相杂交、固相杂交和原位杂交等三种类型。

原位杂交(Hybridization in situ)即原位核酸分子杂交。此法最早(1969)用于细胞内核糖体RNA的定位等研究,现在被广泛用来进行细胞内特殊核酸序列的定性、定位和定量的研究,被称为原位杂交组织化学或原位杂交细胞化学(In situ hybridization cytoehemistry)。它是将重组DNA技术与组织细胞化学技术相结合,在细胞原位显示某种特定基因,mRNA及其产物(特异蛋白)的表达、定位、半定量和变化规律的一种新技术。cDNA的制备因所显示的mRNA的不同而各异,必须借助于重组DNA技术。mRNARNA依赖性DNA聚合酶的作用下,可反转录产生cDNA,因此先提取细胞中已知的特定mRNA,在反转录酶的作用下合成与其互补的cDNA,经限制性内切酶作用后插入载体质粒DNA内。再将该载体转化大肠杆菌,扩增cDNA,然后分离纯化cDNA,最后用缺口平移法进行同位素或生物素标记,作为探针待用。

寡聚核苷酸是一种短小的单链分子,比cDNA更易穿透组织细胞,并且可按基因片段的核苷酸序列人工合成。因此近年来人们常用它来制备核酸探针。

原位杂交细胞化学技术包括分子探针的制备,用同位素或生物素等标记探针,制作组织切片,预杂交、杂交,显色过程和结果观察等。

.试剂和器具

1.试剂

主要试剂有玉米17SrRNAcDNA,缺口平移试剂盒,硝酸纤维素膜,去离子甲酰胺,焦碳酸二乙酯,鲑精子DNA,纯牛血清白蛋白(BSA)LB培养基,氨苄青霉素,葡聚糖,溶菌酶,十二烷基硫酸钠(SDS)EDTA,生物素(Bio-dUTP),金标链霉亲和素,柠檬酸,柠檬酸钠,氯化钠,对苯二酚,AgNO3,异丙醇,疏基乙醇(DTT),醋酸钾,冰醋酸,酚,氯仿,乙醇等。

2.器具

主要器具有高速离心机,电泳仪,真空干燥箱,恒温摇床,超声波发生器等。

环境、器皿的清洁和药品的纯度是该实验成功的关键。RNA容易被RNA酶水解,而RNA酶非常稳定,所以标本和药品及器皿中应避免RNA酶的污染。

.rDNA探针的制备和标记

本实验所用探针是玉米17SrRNAcDNA,它是以1.5kb的片段插入在PBluescriptSK()MCSsaci位点上。

1.重组质粒的转化

(1)将大肠杆菌(E·coli)JM109单菌落接在5ml LB培养液中,37振荡培养过夜。

(2)1%的接种量接入50ml LB培养液中,37振荡培养至OD600大约为0.3-0.4时倒入离心管,冰浴10min4000rpm离心10min,收集菌体。

(3)将菌体悬浮于25ml预冷的50mmol/LCaCl2溶液中,冰浴30min。离心收集菌体,并重新悬于3ml 50mmol/lCaCl2中。0放置12-16h,使之成为感受态细胞。

(4)取重组质粒0.1μg,加在200μl感受态菌体中,冰浴30min,于42热休克2min后再冰浴2min

(5)lml LB培养液加入到上述菌液中,37培养45min。逐级稀释后,用内含氨苄青霉素(60μg/ml)LB培养液涂平板,37培养至菌落出现。

2.转化子的筛选及检测

(1)对在氨苄青霉素平板上长出的菌落进行一次复筛,并培养菌体。

(2)按照微量DNA的提取方法(Sambrok et al.,1989)提取微量DNA,进行电泳,检测出含有重组DNA质粒的转化子。

3.重组质粒DNA的扩增及制备

(1)将经过复筛的菌落,按1中方法(2)进行大量培养。

(2)200ml培养液,4000rpm离心10min,收集菌体,弃上清液。

(3)加入4ml溶液(50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris10mmol/L EDTApH80),加入溶菌酶至终浓度为4-6mg/L,振荡混匀,冰浴10min

(4)加入8ml新配制的溶液(0.2N NaOH10SDS),温和颠倒离心管5次,冰浴5-10min

(5)加入6ml预冷的溶液(5mol/L醋酸钾60ml,冰醋酸11.5ml,重蒸水28.5ml),颠倒离心管使之均匀后冰浴15min

(6)12000×g离心20min,弃去沉淀。

(7)上清液加2倍体积的冷乙醇,-20放置1h以上。

(8)12000×g离心20min,弃上清液,取沉淀,真空干燥。

(9)将沉淀溶于500μl TEB(10mmol/LTris-HCllmmol/L EDTApH7.5),加RNase20μg/ml37作用1-4h,以除去RNA

(10)加等体积的饱和酚,振荡混匀后,10000rpm离心6min,取液相。

(11)在液相中加入等体积的酚:氯仿(11),振荡混匀后10000rpm离心6min,取液相。

(12)在液相中加入等体积氯仿,振荡混匀,10000rpm离心6min,取液相,并加入2倍体积的冷乙醇,-20沉淀DNA

(13)离心收集DNA沉淀,用70%乙醇洗涤3次,真空干燥后溶于TEB中,备用。

4.rDNA片段的制备

(1)对所得重组质粒DNA进行Sac酶切,反应体系如下:Sac 4μl(20单位),质粒DNA 50μl(20μg)10×缓冲液(0.5mol/L Tris-HClpH7.550mmol/L MgCl2)10μl,灭菌重蒸水36μl

(2)将反应后的混合物进行琼脂糖凝胶电泳2-3h,在紫外灯下确定DNA片段的位置,从凝胶上切下相应DNA片段的凝胶块。

(3)将上述凝胶块装入透析袋中,一端扎紧,加入450μl 0.2×TEB(10mmol/LTris-HClpH7.51mmol/L EDTA),排除气泡,封上另一端。放入电泳槽中进行电泳,300V电泳1.5h,反向通电1min

(4)从透析袋中吸出溶液,再加450μl 0.2×TEB冲洗透析袋,两次溶液合并后以12000rpm离心15min,除去凝胶碎块。

(5)用酚、酚/氯仿、氯仿抽提后,加入2倍体积乙醇,沉淀DNA片段,再用70%乙醇洗涤并真空干燥,用TE溶解待用。

5.rDNA片段的生物素标记

本实验用的标记方法是缺口平移法(Nick-translation)。其原理是在未标记的DNA探针溶液中加一定量的DNaseDNA聚合酶以及生物素(或同位素)标记的三磷酸核苷酸。DNaseDNA双链上随机切开若干个有3'-OH末端的单链切口,DNA聚合酶则利用标记的三磷酸核苷酸按5' -3' 方向重新修补缺口,此新合成的DNA的两条链上均匀地被带上标记物。其标记方法如下。

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