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培养细胞的保存和复苏
 

做实验前要先学会冻存,以备自己在后面的实验中能保持同一来源、稳定可靠的细胞,且可减少污染或其它不利影响。

1、影响冻存细胞活性的因素

1)细胞冻存保护剂:常用的有二甲基亚砜(DMSO)和甘油,常用的浓度为5%-10%90%小牛血清)。DMSO对二倍体细胞的毒性较甘油小。

2)细胞悬液的冻结速度:慢冻时冰冻在细胞外形成,因此不致损害细胞。多数细胞以每分钟下降1的速度,降至-20冻结。均可获得满意效果。

3)保存温度:液氮罐,可达到-196,此时所有的物理化学活动均降至最低限度,以保证细胞长期保存。

4)复苏:急速融化复苏可防止损害细胞。冻结细胞从液氮中取出后,应立即放入37~43的水浴中,30秒至一分钟内融化。

2、冻存与复苏方法

适用于原始组织、原代细胞和细胞系(株)。

1)细胞用胰蛋白酶+EDTA消化后用冻存液稀至2~5X106/ml

2)分装于2ml冻存管中,装量1ml,封口,作好标记,用几层纱布扎好。

3 冻存管进入液氮前应有一个渐降温的过程,以1/min的速度降温,一般挂在液氮上空8小时后,投入液氮贮存罐中长期保存。

4)为使冻存的细胞复苏,将冻存管置于37~43水浴中,充分摇动使其急速融化,30秒至1分钟内完成。

5)细胞悬液低速离心,去除上清中的保护添加剂,加入原来使用的生长液,置37培养。

基本设备和试剂

设备(略),环境要求清洁、空气干燥和无烟尘。

基本试剂

培养液:1640溶于新蒸的三次蒸馏水中,搅拌使其充分溶解,过滤除菌即可。小牛血清用前56X30分钟灭活(破坏补体)分装置-20保存备用。青链双抗液将100万单位的青霉素钠盐和硫酸链霉素用高压2次后的三蒸水100ml充分溶解,分装冻存于-20,使用前融化,每100ml生长液中加1ml,即使用终浓度为含P.S 100μg/ml。(注:P.S不能冻融多次,应少量分装,一次用完)。NaHCO3液,用于调整pH值,常用浓度为5~6%,配制用三蒸水溶解后过滤除菌或高压灭菌,分装4保存。胰蛋白酶在pH 8.0,温度37时作用力最强(详见配方)。EDTA液(详见配方)。

附:

胰酶消化液配方(500ml

NaCl 4g

KCl19%1 ml

Na2HPO4 0.126g12H2O

Tris1.5g(三羟甲基氨基甲烷)

以上药物充分溶解后加水至500 ml,然后再加胰蛋白酶5g,最后用1N HCLpH7.7,过滤除菌分装,然后-20保存备用。

EDTA液配方(0.2% 1000ml

EDTAversene 2 g

NaCl 8g

KCl 0.2g

Na2HPO412H2O 2.9g

KH2PO 40.2g

以上药物同样充分溶解后,加新鲜的三蒸水至1000 ml,分装然后高压1530分钟灭菌,最后4保存备用。

细胞冻存液:小牛血清90℅与二甲基亚砜(DMSO10℅混合;-20冰箱保存备用。或小牛血清30℅1640培养液60℅DMSO10℅混合; - 20冰箱保存备用。

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